مسترمیکس سایبرگرین SYBR Green qPCR Mastermix ، محصولی ساخت ایران می باشد که کارایی بالاتر نسبت به نمونه های خارجی دارد، مسترمیکس سایبرگرین ساخت شرکت دانش بنیان نوترکیب ( شرکت فناوری سلامت پرتوژن ) می باشد.
مسترمیکس سایبرگرین SYBR Green qPCR Mastermix
مسترمیکس سایبرگرین نوترکیب با اصول علمی و طراحی بسیار هوشمند ، کارایی مسیر PCR را بالا می برد . مسترمیکس سایبرگرین برای روش ریل تایم PCR طراحی شده و به صورت علمی اختصاصی شده است . مسترمیکس سایبرگرین با آنزیم ها ، از طریق فرآیند مولکولی و با رنگ فلورسنت، بطور منحصرفردی نیازهای کاربران ریل تایم PCR در انجام واکنش زنجیره ای پلیمزار را حاصل کرده است و با اتصال به DNA دو رشته ای و ایجاد سیگنال فلورسنت مقدار محصول dsDNA تولید شده را، مشخص میکند.
| 1 ml | Size |
| notarkib | Brand |
| Gene expression analysis , Low copy gene detection , Microarray validation ,Gene knockdown validation | Applications |
| Antibody base | Features |
یکی از محصولاتی که در نوترکیب تولید می شود و توسط دانشمندان بیوتکنولوژی کشورمان توسعه پیدا کرده است و پس از آزمایش های فراوان و تست هایی که بر روی آن انجام شده است ، نتیجه چشمگیری در زمینه ریل تایم دارد . یکی از محصولاتی که تولید شرکت یکتا تجهیز آزما می باشد و پس از ارزیابی ، نتیجه و بازخورد چشمگیری در زمینه ی کار ریل تایم داشته است .
دانلود پروتوکل استفاده از مسترمیکس در PCr
آموزش PCr و استفاده از مسترمیکس سایبرگرین و RT-PCR
ریل تایم پی سی آر (Real time PCR)
اختراع واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR )نقطه عطفی در تاریخ علوم زیســتی و پزشکی است. کاربرد PCR نه تنها به طور کامل در زمینه تحقیقات ژنتیک مولکولی به خصوص در بیوتکنولوژی جانوری و گیاهی انقلابی ایجاد کرده است بلکه این تکنیــک، ارتباط و کارایی مبتکرانه خود را در زمینه های دیگر علم پزشکی قانونی، سیستماتیک مولکولی، اپیدمیولوژی مولکولی، باستان شناسی، مردم شناسی، ژنتیک تکاملی و غیره نیز ثابت کرده است. PCR سنتی منجر به ظهور ،PCR-RT qPCR و ترکیب qPCR/PCR-RTشده است. همچنین PCR قادر اســت با موفقیت پروژه ژنوم انسان را از طریق توانایــی تکثیر و توالی یابی ژن های انســان، تکمیل کند که بیشــتر پایه و اساس مهندسی ژنتیک شــده است و حتی در حال حاضــر ایجاد تغییرات مفید در ژنوم یک ارگانیســم را امکان پذیر ســاخته است. واریانت های PCR در بسیاری از پیشــرفت های اخیر که علوم دوره مدرن را ایجاد کرده اند به طور موفقیت آمیزی مورد استفاده واقع شده است.
واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR )
ســنگ بنــا در زمینــه ژنتیــک مولکولــی توســط Francis Crick و James D. Watson در سال 1953 با ارائه مدل ســاختار دو رشــتهای DNA گذاشــته شــد. در اوایل 1960 ،توســط دکتر Khorana Gobind ، برنده جایزه نوبل در ســال 1968 پیشرفت های قابل توجهی ، جهت روشــن سازی کد ژنتیکی و ســنتز اولیگونوکلئوتیدها که بــه عنوان الگوی پرایمری برای DNA پلیمراز اســتفاده
می شــوند، حاصل شــد. در ســال 1971 ،Kleppe Kjell پژوهشــگر آزمایشــگاه Khorana ،همانند سازی قطعه ای از DNA را با اســتفاده از سیســتم دو پرایمری توصیف کرد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز یک تکنیک آزمایشــگاهی است که همانند سازی و تکثیر قطعه ای از DNA را به میلیون ها برابرآن امکان پذیر می سازد. تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز )PCR ) توسطMullis Banks Kary ،در ســال 1983 وقتی که وی به عنوان بیوتکنولوژیســت در موسسه Cetus، Emeryville کالیفرنیای آمریکا کار می کرد، ابداع شد. در سال 1985 سرمایه گذاری مشــترک بین موسســه Cetus و Elmer-Perkin ، دیگر شرکت آمریکایی بیوتکنولوژی جهت طراحی ابزار چرخه حرارتــی و معرف ها برای PCR صــورت گرفت و در 1987 مطبوعات خبر دسترسی تجاری »Cycler Thermal 1000-PCR »و»DNA پلیمراز AmpliTaq »منتشر کردند، این اختراع، جایزه نوبل افتخارات خود را در شــیمی و همچنین جایزه ژاپن را در سال 1993 از آن خود کرد.
اجزای لازم برای PCR استاندارد
اجزای مخلوط واکنش:
- Taq/دیگر پلیمرازهای مقاوم به حرارت
- DNA الگو
- پرایمرها
- داکسی نوکلئوتید تری فسفات ها )dNTPs)
- MgCl 2
- پیپت خودکار/ظروف پالستیکی/دستکش
- دستگاه چرخه حرارتی (ترمال سایکلر)
Taq و دیگر پلیمرازهای مقاوم به حرارت
درسال Thomas D. Brock ،1969 ترموفیلــوس اکواتیکــوس، گونه جدیــدی از باکتری گرما دوســت موجود در بخش زیرین چشــمه آب گرم پــارک ملی Yellowstone جداســازی کرد. در سال 1976 آنزیم مقاوم به حرارت »پلیمراز Taq »از aquaticus Thermus ایزوله شــد در سال 1986 HenryErlich ،اســتفاده از پلیمــراز Taq را در PCR خبر داد، چون این آنزیم میتواند فعالیت خود را در طیف وسیعی از درجه حرارت باال حفظ کند اضافه کردن آن به مخلوط PCR ، کل رونــد PCR را بدون نیاز به اضافه کردن دســتی DNA پلیمــراز تازه از اشریشــیاکلی در هر چرخــه واکنش، کوتاه تر میکند زیرا DNA پلیمراز اشریشیا کلی قادر به تحمل گرمایش
و ســرمایش سریع نیست. مسیر سنتیکی Taq پلیمراز در سنتز رشته الگو با واردکردن نوکلئوتیدی ها به وسیله Rothwell وWaksmanدر 2005 توصیف شــده است. بسیاری از DNA پلیمرازهای مقاوم به حرارت نیز کشــف شــده اند که میتوان برحســب کاربردشان از آنها اســتفاده کرد.معمولا 5U.1-1از DNA پلیمــراز Taq در 50μl از مخلوط واکنش مورد نیاز است. با این حال اگر مهارکننده ها (مثل درجه خلوص پایین DNA الگو) در مخلوط واکنش وجود داشته باشد، مقدار بالای DNA پلیمراز Taq
(3U-2)جهت حصول بازده بهتر محصولات تکثیرشده، لازم است.
DNA الگو
معمولا 1ng -01.0 از DNA الگو برای DNA پالسمید یا فــاژ و 1µg -1.0 برای DNA ژنومــی در 50μl مخلوط تام واکنش مورد نیاز است. DNA الگوی بیشتر از این مقدار سبب تولید فــرآورده های غیر اختصاصی PCR می شــود؛ بنابراین DNA باید خالص باشد به طوری که، حتی وجود مقدار خیلی جزئی از فنول، EDTA ،پروتئیناز K و غیره مورد اســتفاده در جداســازی DNA ،شدیدا فعالیت DNA پلیمراز Taq را مهار می کند. با این حال رســوب DNA با اتانول و شستشوی پلیت DNA با اتانول 70 %معموال در حذف این آلودگی ها از نمونه DNA مؤثر هستند.
پرایمرها
موضوع بســیار مهم برای تکثیر جایگاه های هدف در داخل
یک ناحیه ای از ژنوم، طراحی پرایمر است. پرایمر موفق عمدتا
برای دستیابی به دو هدف یعنی ویژگی و کارایی طراحی میشود.
در صورتی که پرایمرها جهت پیشــگیری از نتایج مثبت کاذب،
با دقت کافی طراحی شــوند هردوی این اهداف دســت یافتنی
میباشند. در زیر ملاحظاتی که هنگام طراحی پرایمر باید در ذهن داشته باشیم آورده شده است.
طول پرایمر: طول یک پرایمر به طور مستقیم با ویژگی واکنش
PCR متناسب اســت. همچنین طول پرایمر، دمایی را مشخص
میکند که در آن پرایمر به DNA الگو متصل خواهد شد. معمولا پرایمرها در طولی بین 18 تا 24 باز طراحی می شــوند اگر چه حداقل طول پرایمر به وسیله اندازه ژنوم تعیین می شود.
محتوای GC
محتوای GC مهم اســت زیرا مقدار Tm یک
توالی را تعیین می کند. اولیگونوکلئوتیدی با طول 20 جفت بازی و
حاوی 50 %CG معموال مقدار Tm بین 56-62 درجه سانتیگراد
دارد. محتوای GC بســیار مطلوب باید Tm بین 40 تا 60 درجه
ســانتیگراد داشته باشــد. از وجود بیش از سه نوکلئوتید G یا C
در انتهای ‘3 پرایمر باید اجتناب شــود زیرا ممکن است منجربه
پرایمینگ غیر اختصاصی )اتصال غیراختصاصی پرایمر( شود.
دمــای ذوب (Tm) :
ازآنجاییکــه در یــک واکنش PCR
مجموعهای از پرایمرها اســتفاده میشــوند از این رو باید سعی
شــود تا جفت پرایمری هایی انتخاب شــوند که Tm آن ها از
همدیگر بیش از 5 درجه ســانتیگراد اختالف نداشــته باشــند،
بنابراین محتوای GC و طول پرایمر باید بر این اســاس انتخاب
شوند. معموال Tm در دامنه 70-62 درجه سانتیگراد قرار دارد.
برآورد دمای ذوب و دمای آنلینگ پرایمر: برای پرایمرهای
کمتــر از 25 نوکلئوتید، تقریبا Tm با اســتفاده از فرمول زیرین
محاسبه می شــود: که در T، A، C، G تعداد نوکلئوتیدی های
مربوطه در پرایمر هست: Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
وارد کردن جایگاه محدود کننده: 6-3 نوکلئوتید به انتهای ‘5
پرایمر اضافه می شــود بنابراین به طور موفقیت آمیزی جایگاهی
برای برش محدود کننده در توالی های تکثیر شده، فراهم می کند.
مکمــل بودن پرایمر: پرایمر نباید مکمل خود یا مکمل دیگر
پرایمرهای موجود در مخلوط واکنش باشــد، از این رو از وجود
همولوژی داخل و بین پرایمرها باید پرهیز شــود زیرا می تواند
منجر به ایجاد دیمر پرایمر شود.
تکرار بازها: از تکرار باز منفرد یا دو باز برای 4 مرتبه یا بیشتر
باید پرهیز شود.
نوکلئوتیــد انتهایی در پرایمــر PCR :موقعیت انتهایی در
پرایمر جهت حذف جفت شــدن ناجور ضروری اســت. برای
پرهیــز از آن، از پرایمرهایی کــه در انتهاهای ‘3 خود مکمل
هســتند، اجتناب شــود زیرا این امر ممکن است سبب تشکیل
غیرضروری دیمر پرایمر شود.
ساختارهای ثانویه: از ایجاد ساختارهای ثانویه حتی المقدور
باید پرهیز شود، ســاختارهای ثانویه در نتیجه واکنش های بین
مولکولی یا درون مولکولی به وجود می آیند. ســنجاق ســرها،
دیمرهای خودی، دیمرهای متقابل، همه در نتیجه ســاختارهای
ثانویه حاصل می شوند.
رنگ سایبرگرین یا به عبارتی SYBR Green ، با حضور بین دو پایه ی رشته ی DNA ، با مولکول های DNA اتصال بر قرار می کند
ین اتصال سبب بالا رفتن تعداد مولکول های سایبرگرین برای انتشار نور می گردد .
نظرات کاربران