بیاید برای شروع اول ببینیم DNA چیه؟؟؟؟ بعد بریم سراغ شیوه استخراج DNA به صورت تخصصی…
فهرست مطالب
DNA چیست؟
دئوکسی ریبونوکلئیک اسید به اختصار DNA گونه ای از اسیدهای نوکلئیک است که دارای دستورالعمل های ژنتیکی است برای توسعه زیستی و عملکرد جانداران و ویروس ها مورد استفاده قرار می گیرد. نقش اصلی رشته مولکول DNA ذخیره سازی طولانی مدت اطلاعات ژنتیکی، دستوری و رفتاری است.
چرا استخراج DNA اهمیت دارد؟
در دنیای امروزی تجزیه و تحلیل DNA اهمیت زیادی دارد، زیرا اهمیت DNA خالص و با کیفیت بالا را نمی توان دست کم گرفت. یافتن یک سیستم جداسازی DNA مناسب برای برآوردن نیازهای کاربرد پایین دست شما برای تکمیل موفقیت آمیز آزمایش ها حیاتی است. پایه و اساس تمامی تحقیقات بیوتکنولوژی کندوکاو و آنالیز DNA است و در سال های اخیر گسترش و توسعه تکنیک های استخراج و ترکیب آن ها، سبب انقلابی را در درمان بسیاری از بیماری های از جمله انواع سرطان ها، اغلب بیماری های خود ایمنی مانند دیابت و همچنین تشخیص، پیشگیری و درمان بسیاری از بیماری های مادرزادی فراهم شده است.
تاریخچه استخراج DNA
استخراج DNA برای نخستین بار در سال ۱۸۶۹ توسط فردریش میشر یک پزشک سوئیسی انجام گرفت. او تلاش کرد که برای قطعیت بیشتر و بهبود نتایج به دست آمده از آزمایشات خود، سلول ها را از غدد های لنفاوی استخراج کند، اما تامین غلظت مناسبی از لنفوسیت ها (نوعی گلبول های سفید خون) بسیار دشوار و حتی غیرممکن بود.
در نتیجه، سلول موردنظر او به لوکوسیت ها(نوع دیگری از گلبول های سفید خون) تغییر یافت که از چرک تجمع یافته در پانسمان‌های جراحی به دست می آمدند. در ابتدا، تمرکز میشر روی انواع مختلف پروتئین هایی بود که لوکوسیت ها را تشکیل می دهند و متوجه شد که پروتئین ها ماده اصلی تشکیل دهنده سیتوپلاسم سلول( تمام محتویات داخل یک سلول به جز هسته آن سلول) می باشند. در حین این آزمایشات، میشر متوجه شد که در صورت افزودن اسید به محلول، ماده ای ته نشین شده و با افزودن باز دوباره حل می‌گردد. به این ترتیب برای نخستین بار، رسوب ناخالصی از DNA به دست آمد.
DNA استخراج شده به چه منظور استفاده می شود؟
استخراج DNA اول مرحله در فرآیند تشخیص باکتری و ویروس ها در محیط زیست و نیز تشخیص بیماری ها و اختلالات ژنتیکی استفاده می شود.این تکنیک ها شامل 3 روش زیر است:
1=فلورسانس در حالت هیبریداسیون(FISH):روش مولکولی بیشتر برای شناسایی و شمارش گروه های باکتری خاص
2=پلی‌مورفیسم قطعه انتهایی هضم‌شده(T-RLFP):برای شناسایی، مشخص نمودن و تعیین الگوهای مکانی و زمانی در جوامع باکتری اپی‌پلانکتون دریایی استفاده می‌شود.
3=توالی یابی:بخش‌هایی یا کل ژنوم ممکن است دارای توالی و همچنین عناصر کروموزومی اضافی برای مقایسه با توالی موجود در مرکز جمع آوری ژن باشد.
روش استخراج DNA
پنج مرحله اساسی استخراج DNA وجود دارد که در تمام محلول های ممکن برای استخراج DNA سازگار است:
- اختلال در ساختار سلولی برای ایجاد لیز
- جداسازی DNA محلول از بقایای سلولی و سایر مواد نامحلول
- اتصال به DNA مورد علاقه ماتریکس تصفیه
- شستشوی پروتئین ها و سایر آلاینده ها از ماتریکس
- شستشوی DNA
مرحله اول ایجاد لیز
اولین مرحله در هر واکنش خالص سازی اسید نوکلئیک، رهاسازی DNA/RNA در محلول است. هدف از لیز این است که به سرعت و به طور کامل سلول های یک نمونه را مختل کند تا اسید نوکلئیک را در لیز آزاد کند. چهار روش کلی برای لیز کردن مواد وجود دارد: روش های فیزیکی، روش های آنزیمی، روش های شیمیایی و ترکیبی از این سه روش.
مرحله دوم جداسازی DNA محلول از بقایای سلولی و سایر مواد نامحلول
بسته به ماده اولیه، لیزهای سلولی ممکن است نیاز به حذف بقایای سلولی قبل از خالص سازی اسید نوکلئیک داشته باشند تا انتقال مواد ناخواسته (پروتئین‌ها، لیپیدها و ساکاریدها از ساختارهای سلولی) به واکنش تصفیه کاهش یابد، که می‌تواند غشاها را مسدود کند یا در پایین‌دست تداخل ایجاد کند. برنامه های کاربردی. معمولاً پاکسازی با سانتریفیوژ، فیلتراسیون یا روش های مبتنی بر مهره انجام می شود.
سانتریفیوژ می‌تواند به زمان عملی بیشتری نیاز داشته باشد، اما می‌تواند مقادیر زیادی زباله را برطرف کند. فیلتر کردن می تواند یک روش سریع باشد، اما نمونه هایی با مقدار زیادی زباله می توانند فیلتر را مسدود کنند. پاکسازی مبتنی بر مهره، مانند روشی که با کیت های آماده سازی پلاسمید مبتنی بر ذرات Promega استفاده می شود، می تواند در پروتکل های خودکار استفاده شود، اما می تواند با زیست توده غرق شود. هنگامی که یک لیز پاک شده تولید شد، DNA را می توان با بسیاری از شیمی های مختلف، مانند سیلیس، تبادل یونی، سلولز یا روش های مبتنی بر رسوب خالص سازی کرد.
مرحله سوم اتصال به DNA مورد علاقه ماتریکس تصفیه
صرف نظر از روشی که برای ایجاد یک لیز پاک شده استفاده می شود، DNA مورد نظر را می توان با استفاده از روش های مختلف جدا کرد. Promega سیستم‌های استخراج DNA ژنومی را بر اساس لیز نمونه توسط مواد شوینده و خالص‌سازی با اتصال به ماتریس‌ها (سیلیکا، سلولز و تبادل یونی) ارائه می‌کند، که در سال‌های اخیر توجه عمده‌ای به آن جلب شده است.
هر یک از این ترکیبات شیمیایی می تواند بر کارایی و خلوص جداسازی تأثیر بگذارد و هر کدام دارای ظرفیت اتصال مشخصی هستند. ظرفیت اتصال نشان دهنده این است که شیمی جداسازی اسید نوکلئیک چقدر می تواند قبل از رسیدن به ظرفیت سیستم متصل شود و دیگر مقدار بیشتری از آن اسید نوکلئیک را جدا کند. ما می‌توانیم ویژگی‌های طراحی را در این شیمی‌ها با دستکاری شرایط اتصال برای غنی‌سازی دسته‌های مختلف اسید نوکلئیک بسازیم (به عنوان مثال، شیمی‌هایی که به طور انتخابی RNA را در مقابل DNA یا قطعات بزرگ در مقابل قطعات کوچک متصل می‌کنند).
مرحله چهارم شستشوی پروتئین ها و سایر آلاینده ها از ماتریکس
بافرهای شستشو به طور کلی حاوی الکل هستند و می توانند برای حذف پروتئین ها، نمک ها و سایر آلاینده ها از نمونه یا بافرهای اتصال بالادست استفاده شوند. الکل ها علاوه بر این به پیوند اسید نوکلئیک با ماتریکس کمک می کنند.
مرحله پنجم شستشوی DNA
DNA در محلول های کم قدرت یونی مانند بافر TE یا آب بدون نوکلئاز محلول است. هنگامی که چنین بافر آبی روی غشای سیلیکا اعمال می شود، DNA از سیلیس آزاد می شود و مایع خروجی جمع آوری می شود. پس از آن DNA خالص شده و با کیفیت بالا آماده استفاده در طیف گسترده ای از کاربردهای پایین دستی، مانند Multiplex PCR، سیستم های رونویسی/ترجمه در شرایط آزمایشگاهی، واکنش های ترانسفکشن و توالی یابی است.
و در آخر پس از انجام تمامی مراحل با کمترین خطا ،ما DNA خالص به دست می آوریم تا با تجزیه و تحلیل آن به علم بیولوژیک کمک کنیم.
در پیویو بیشتر بخوانید:
https://pioio.com/mag/2021/02/16/%da%a9%d9%86%d8%aa%d8%b1%d9%84-%d9%84%db%8c%d8%b2%d8%b1-%d8%a8%d8%a7-dna/ https://pioio.com/mag/2022/02/28/eugenics/
نظرات کاربران